Caracterización y Conservación de Variedades de Vid: Métodos y Desafíos
Ampelografía: Identificación y Clasificación de la Vid
La ampelografía es el campo de la botánica que se dedica a la identificación y clasificación de las vides (Vitis vinifera), sus variedades y frutos. Esta caracterización se lleva a cabo a través de un conjunto de descriptores basados en la morfología de los diferentes órganos de la vid, en el momento adecuado para su observación y en el desarrollo del órgano a describir; a estos descriptores se les asigna un nivel de expresión concreto. Se estudian caracteres tanto cualitativos (superficie del pámpano: lisa, estriada…) como cuantitativos (tamaño de la baya: longitud, anchura…), por lo que mide la ausencia o presencia de determinados caracteres, cuantificando el nivel de expresión.
En un principio, el estudio ampelográfico consistía en describir la morfología de la vid, sin importar la genética. Actualmente, con la integración de marcadores moleculares, esta descripción tiende a ser más objetiva, pudiendo establecer una “huella genética” de las variedades.
La OIV ha formalizado una lista con una serie de descriptores, de los cuales, al menos 36 deben ser necesariamente descritos para identificar nuevas variedades de vid reconocidas por la UPOV. Los demás caracteres sólo se requieren de forma excepcional para descripciones concretas.
Se han descrito más de 10.000 variedades de vid por métodos ampelográficos.
Ventajas de la Ampelografía
- Completa la caracterización de una variedad (complemento de análisis genético).
- Modo de caracterización barato.
- Corrección de errores a la hora de denominar una variedad (sinonimias: variedades diferentes llamadas del mismo modo, homonimias: misma variedad denominada de distinta manera).
Desventajas de la Ampelografía
- Falta de objetividad si no se complementan con estudios genéticos.
- Depende de las condiciones ambientales.
- Requieren gran cantidad de tiempo de análisis y su interpretación.
- A la hora de diferenciar clones o mutaciones dentro de una variedad, no es muy eficaz.
Amenazas a la Biodiversidad de la Vid
En Europa
- Plagas (filoxera).
- Abandono de tierras agrícolas (vitícolas).
- Sustitución de variedades locales por variedades más conocidas.
- Selección clonal.
En países emergentes para la viticultura
Nuevas plantaciones usan pocos clones de pocas variedades, lo que provoca fuerte erosión genética.
Otras amenazas
- Cambio climático: calentamiento global; menos lluvias y más imprevisible.
- Erosión genética: problemas de adaptación a nuevas condiciones; restricciones de los Consejos Reguladores; limitación de nuevas variedades.
- Preocupaciones medioambientales y sanitarias: mayor control sobre productos fitosanitarios; menos fitosanitarios/menos laboreo.
Situación del Patrimonio Genético de la Vid en España
En España el 80% de la superficie vitivinícola la ocupan 8 variedades. Se ha producido un cambio hacia variedades conocidas y demandadas, por lo que otras variedades que no tienen interés se dejan de cultivar. Influyen los consejos reguladores.
Se ha realizado una selección clonal de 56 variedades, más de 700 clones. Se ha hecho selección clonal sobre variedades minoritarias, seguramente con poca variabilidad genética interna. El avance más importante es la selección sanitaria y curación: clones libres de virus.
PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
La PCR (Polymerase Chain Reaction) es un método de replicación in vitro (amplificación: replicación sucesiva del ADN inicial y acumulación exponencial del producto) de una secuencia diana de ADN particular presente en una mezcla compleja. Se basa en el proceso de replicación del genoma (a partir de una doble hebra de ADN se obtienen 2 dobles hebras). El resultado es un fragmento de ADN de tamaño y secuencia definidos.
Metodología de la PCR
- Extracción de ADN.
- Amplificación, por etapas: Desnaturalización, Hibridación con iniciadores y Replicación (cíclico).
- Análisis de los fragmentos ampliados: Electroforesis (análisis cualitativo: tamaño del amplímero), Reamplificación/Nested y semi-Nested, Determinación de poliformismos de restricción y Secuenciación de amplímeros o hibridación con sondas.
- Mantenimiento: 4ºC o -20ºC.
Reactivos requeridos para la PCR
- Material biológico (ADN de partida, Oligonucleótidos sintéticos de secuencias conocidas, dNTPs y polimerasa termoresistente, es decir, tampón con Mg++).
- Termociclador.
- Otro material de laboratorio (micropipetas, baños termostatizados, sistemas de electroforesis).
Parámetros críticos de la PCR
- Temperatura de hibridación: Es el parámetro más crítico de la amplificación; el primer ciclo puede determinar el resultado. Esta temperatura depende de la longitud y de la secuencia de iniciadores (temperaturas menores a las recomendadas pueden rebajar la especificidad y dar bandas inespecíficas y T mayores hacen la hibridación más restrictiva).
- Número de ciclos: Tan bajo como sea posible (al aumentar el número de ciclos, se pueden amplificar regiones que contengan errores; especialmente importante en condiciones poco restringidas). 30-45 lo habitual (25 pueden ser suficientes).
El programa de amplificación depende de estos parámetros críticos, por lo que hay que tener en cuenta: Se suele hacer la hibridación a 55ºC si el %C+G es menos al 50% y a 60ºC si es mayor.
Se calcula aprox. 1ºC por pareja de AT y 2ºC por pareja CG (se hibrida 5ºC por debajo de la temperatura de fusión). Por lo que para la 1º serían 55ºC atendiendo al % de bases y para la 2º, 60ºC.
Usos de la PCR en Viticultura y Enología
- Identificación de cepas de levaduras.
- Identificación de categorías subespecíficas de Vitis.
- Identificación de OGMs: levaduras, vides, bacterias…
- Identificación de patógenos (hongos, fitoplasmas) en campo.
- Identificación de bacterias en la bodega.
- Establecimiento de mapas genéticos.
- Búsqueda de genes candidatos (LD).
Selección Masal y Clonal
Selección masal: es un método de mejora en el cual plantas individuales son elegidas en base a su fenotipo. Es decir, se seleccionan las que, por ejemplo, tienen mejor aspecto, más vigor, o dan las mejores uvas, y se utilizan esas plantas para reproducirlas asexualmente.
Selección clonal: de forma protocolaria se selecciona material vegetal que sabemos que está sano e identificado, se estudia su comportamiento en campo y se asegura material vegetal sano para su reproducción asexual en campo. Sus principales atributos se deben a que es posible caracterizar el genotipo seleccionado en distintos ambientes y se puede conocer y resguardar el estado sanitario de la planta (clon).
OGMs en Viticultura y Enología
Los OGMs (Organismos Genéticamente Modificados) son organismos manipulados genéticamente. Se pueden obtener de distintas formas: Aislamiento de ADN (unidad replicativa (vector); inserto (homólogo/heterólogo)); Ligamiento en vector autoreplicativo (replicones o integración en genoma); Transformación; Selección de transformantes; Amplificación.
Aplicaciones de la Tecnología de OGMs en Viticultura y Enología
Sí, se podría utilizar esta tecnología en viticultura y enología en aplicaciones industriales: levaduras, bacterias, enzimas, aditivos… etc, y para la obtención de plantas de vid transgénicas.
Ventajas, Inconvenientes y Problemas del Uso de OGMs
Uno de los problemas es que el material genético de interés que se ha introducido en el ADN de la planta, levadura o bacteria se transmita limitadamente o no se transmita a sus descendientes.
Ventajas: Universalidad (plantas y otros seres vivos); Rápido, sencillo y eficaz; Éxito en transformación de mitocondrias y cloroplastos; Muy útil en expresión transitoria.
Inconvenientes: Proceso no controlado (superficie diana rugosa; proyectiles con fuerzas variables); No suele permitir regeneración; Pueden producirse reorganizaciones genéticas durante la integración; Rechazo popular.
Homonimias y Sinonimias en la Vid
Las sinonimias consisten en denominar a la misma variedad de vid con distinto nombre, como Tempranillo y Cencibel.
Las homonimias consisten en denominar con el mismo nombre a variedades distintas de vid, como Tinto Basto, que se le llamaba Tempranillo. Para nombrarlas correctamente, debemos hacer una identificación varietal, mediante técnicas del estudio del ADN y ampelografía.
RAPDs (Amplificación Aleatoria de ADN Polimórfico)
La amplificación aleatoria de ADN polimórfico, más conocida por el acrónimo inglés RAPDs (Random Amplification of Polymorphic DNA), es un tipo de marcador molecular basado en la reacción en cadena de la polimerasa. Los fragmentos de ADN obtenidos por medio de esta técnica se amplifican en regiones aleatorias del genoma ya que los iniciadores o cebadores de la reacción son secuencias arbitrarias de ADN sintético. Es una de las técnicas más versátiles desde que se desarrolló en el año 1990. Es muy cómoda, rápida, requiere poco ADN que además no necesita estar muy puro, no presupone conocimientos previos sobre la secuencia, y se pueden distinguir rápida y simultáneamente muchos organismos.
AFLPs (Polimorfismos en la Longitud de Fragmentos Amplificados)
Los polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados, más conocidos por su acrónimo inglés AFLP (Amplified fragment length polymorphism), son un tipo de marcador molecular que está basado en la restricción del ADN genómico mediante enzimas de restricción y en la subsecuente amplificación de algunos de esos fragmentos mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Son una herramienta poderosa de análisis del genoma dado que poseen un alto poder de detección de la variabilidad genética. El ensayo de AFLP combina la especificidad, resolución y poder de muestreo de la digestión con enzimas de restricción con la velocidad y practicidad de la detección de polimorfismos mediante PCR, sin necesidad de disponer de información previa del genoma a estudiar, lo cual supone una ventaja considerable pues otras técnicas para detección de variabilidad genética necesitan una etapa previa en la cual se secuencia el DNA genómico.